一、介紹

   為了尋求產(chǎn)生終身保持功能的軟骨修復(fù)組織的技術(shù)，已經(jīng)探索了廣泛的方法。1.雖然有些技術(shù)，如自體軟骨細(xì)胞植入（ACI）的各種變體2和關(guān)節(jié)分散注意力3，產(chǎn)生有希望的臨床結(jié)果，這些方法都沒有被證明可以*恢復(fù)適當(dāng)?shù)耐该鬈浌?。另一種在再生醫(yī)學(xué)的其他領(lǐng)域（如膀胱，氣管和腸道的恢復(fù)）中產(chǎn)生了非常有希望的結(jié)果的替代技術(shù)是使用基于去細(xì)胞化細(xì)胞外基質(zhì)（ECM）的支架。4.該技術(shù)的優(yōu)點(diǎn)是創(chuàng)建了一個(gè)天然ECM元素的環(huán)境，該環(huán)境可能仍然包含各種適當(dāng)?shù)纳锘钚跃€索，而沒有細(xì)胞成分的存在，從而避免了免疫學(xué)問題5，6。此外，它確實(shí)允許異種方法，因?yàn)镋CM蛋白在物種之間高度保守。研究已經(jīng)證明了軟骨衍生基質(zhì)（CDM）支架的潛力，因?yàn)榕囵B(yǎng)的間充質(zhì)基質(zhì)細(xì)胞形成了豐富的新的含糖胺聚糖（GAG）和含II型膠原的軟骨基質(zhì) 7.在異位6，8和原位位置的小動(dòng)物模型中的體內(nèi)研究進(jìn)一步強(qiáng)調(diào)了效力9，10。

   CDM支架對(duì)于修復(fù)骨軟骨缺損可能很有趣，因?yàn)樗鼈兛梢远ㄖ瞥晒擒浌侨?，可以以壓接方式插入，避免不安全或?fù)雜的固定技術(shù)，這些技術(shù)可能會(huì)對(duì)周圍和相對(duì)組織造成損傷11.它們也有可能成為現(xiàn)成的產(chǎn)品，因?yàn)椴恍枰踩肭芭囵B(yǎng)。然而，這種方法需要同時(shí)再生骨和軟骨組織。從理論上講，這可以通過使用復(fù)合支架或單個(gè)支架來實(shí)現(xiàn)，該支架將允許根據(jù)周圍的原始組織形成兩個(gè)組織。

   在這項(xiàng)研究中，開發(fā)和使用了一種基于CDM的支架。CDM主要由II型膠原蛋白組成，在沒有GAG和細(xì)胞的情況下12 并且單獨(dú)使用，或與三維（3D）打印磷酸鈣（CaP）水泥基經(jīng)過驗(yàn)證的成骨支架13，14結(jié)合使用以填充馬的股骨顱關(guān)節(jié)中的骨軟骨缺損。馬模型被視為骨科疾病的*佳和挑戰(zhàn)性的模型之一15，16。據(jù)推測(cè)，骨軟骨缺損的軟骨部分會(huì)隨著新組織接近透明軟骨而愈合，并且復(fù)合支架將顯示更好的骨形成并導(dǎo)致更好的整體解剖重建。

二、方法

   （1）實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

   支架植入直徑為11 mm，深10 mm的圓柱形缺陷，這些缺陷是通過手術(shù)在內(nèi)側(cè)股骨車嵴的軸側(cè)形成的。進(jìn)行了為期8周的試點(diǎn)研究，以評(píng)估對(duì)CDM支架的短期反應(yīng)。為了減少實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的使用，使用了一匹注定要被犧牲用于教育目的的馬。在這種情況下，沒有使用CaP腳手架。在為期6個(gè)月的主要研究中，每匹馬都接受了單獨(dú)使用CDM支架（−P）和由CDM和3D打印CaP支架（+P）組成的復(fù)合支架的治療。馬1-4分別接受了左股骨和右股骨葉關(guān)節(jié)的治療-P和+P。對(duì)于馬5-8來說，這是顛倒的。

      （2）手術(shù)

   在用甲苯噻嗪（1.1mg / kg，比薩）靜脈注射（IV）術(shù)前后，靜脈注射（2.2mg / kg，霍利迪）和（0.05mg / kg，霍利迪）誘導(dǎo)馬匹，并將其置于背臥位。 在氧氣中使用異氟醚維持全身麻醉。

   通過中髕韌帶和內(nèi)側(cè)髕韌帶之間5 cm的切口進(jìn)行顱股骺小型關(guān)節(jié)切開術(shù)17。每個(gè)內(nèi)側(cè)股骨滑車嵴中側(cè)的骨軟骨缺損是使用動(dòng)力驅(qū)動(dòng)的鉆頭形成的。在植入前用鹽水溶液（Careflex）沖洗缺陷部位和關(guān)節(jié)。將支架壓接植入每個(gè)缺陷中。將傷口縫合成四層（關(guān)節(jié)囊，深筋膜，淺筋膜和皮膚），并在切口上施加支架繃帶。

    （3）生物力學(xué)測(cè)試

   對(duì)來自同一動(dòng)物的健康軟骨和缺陷組織進(jìn)行了微壓痕實(shí)驗(yàn)。使用帶有球形壓頭（半徑：73μm，懸臂剛度：15.6 N/m）的位移控制納米壓頭機(jī)（荷蘭Piuma）獲得基于壓痕的載荷-位移曲線18.3 × 3 壓痕矩陣 （n = 9），覆蓋 600 × 600 μm2執(zhí)行區(qū)域，對(duì)應(yīng)于每個(gè)點(diǎn)之間的300μm距離。實(shí)際壓痕深度在8微米范圍內(nèi)。楊氏模量是根據(jù)奧利弗-法爾理論計(jì)算的，使用卸載曲線的初始斜率和估計(jì)泊松比0.519.

   經(jīng)過生物力學(xué)測(cè)試，將一半樣品固定在福爾馬林中，并進(jìn)一步加工用于石蠟包埋。從剩余的組織樣品中，切除缺陷的軟組織并進(jìn)行處理以進(jìn)行生化分析。

三、結(jié)果

   （1）尸檢時(shí)的宏觀外觀

   在時(shí)，手術(shù)部位很容易通過軟骨上的壓痕識(shí)別（圖3）;而在植入時(shí)點(diǎn)，植入物已小心地與周圍的軟骨齊平。所有部位的外觀相似，治療之間沒有宏觀上可見的差異。

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圖 3.尸檢時(shí)手術(shù)部位的宏觀視圖（植入后6個(gè)月）。

    （2）生物力學(xué)分析

   生物力學(xué)測(cè)試表明，−P和+P處理的缺陷的修復(fù)組織都非常柔軟（平均楊氏模量302 KPa（CI 177-427）分別為−P和261 KPa（CI 148-374），剛度明顯小于正常相鄰軟骨（平均楊氏模量為−P 2385 KPa（CI 2009-2761）， 對(duì)于 +P 2372 KPa （CI 2036–2708） （P < 0.0001））。−P組和+P組的修復(fù)組織之間沒有差異（P>0.05）（圖5）。

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圖 5.Young修復(fù)組織模量與僅用CDM（−P）或CDM加CaP支架（+P）治療的病變的正常軟骨的模量。*P < 0.0001，n = 8 表示所有組。

  （3）生物化學(xué)

       根據(jù)組織學(xué)觀察，缺陷中的GAG產(chǎn)生有限。−P條件下的GAG，DNA和GAG / DNA值分別為25.67（CI 17.27–34.07）μg/mg組織，1.57（CI 1.35–1.79）μg/mg組織和16.54（CI 12.09–20.99）。對(duì)于−P，這些值為12.32（CI 9.88-14.82）;分別為1.74 （CI 1.63–1.85） 和 7.13 （CI 6.63–8.63）。對(duì)于膠原蛋白參數(shù)，HYP值為11.63（CI 10.47-12.79）和8.78（CI 7.03-10.53）Hyp / mg組織。−P組和+P組間的GAG和膠原蛋白含量無顯著差異（圖6）。

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圖 6.平均GAG（A）和羥脯氨酸（HYP，μg / mg干重;（B）作為膠原蛋白含量的量度，6個(gè)月后修復(fù)組織的含量。

四、討論

        自組織工程早期以來，關(guān)節(jié)軟骨一直是目標(biāo)組織之一。22.然而，很快就發(fā)現(xiàn)，在經(jīng)典的較小實(shí)驗(yàn)室物種中進(jìn)行廣泛的體外測(cè)試，雖然在初始發(fā)育階段仍然是絕對(duì)必要的，但不足以評(píng)估臨床環(huán)境中旨在修復(fù)軟骨或再生的任何療法。23.在較大的模型中，馬模型被認(rèn)為是模型之一，但也被認(rèn)為是挑戰(zhàn)性的模型之一。16.優(yōu)點(diǎn)包括關(guān)節(jié)的大小和可及性，軟骨的厚度和生化成分，這些都接近人類24，以及軟骨下板是閉合的，這在許多較小的物種中并非如此。在模型的缺點(diǎn)中，也許手術(shù)后立即承重可能是最重要的25.關(guān)于馬模型的一個(gè)重要的倫理考慮因素是，馬是主要為了運(yùn)動(dòng)潛力而繁殖和飼養(yǎng)的動(dòng)物。這使得馬與任何其他物種不同，除了狗之外，成為一個(gè)實(shí)驗(yàn)物種，以及一個(gè)目標(biāo)物種，顯然臨床上需要更好地治療（骨）軟骨關(guān)節(jié)疾病。26.

   在這項(xiàng)研究中，馬模型用于評(píng)估用無細(xì)胞CDM支架填充人造骨軟骨缺損的效果，使用（+P）或沒有（−P）陶瓷基底在軟骨下骨中壓接錨定。在為期8周的試點(diǎn)研究中，僅植入CDM植入物的結(jié)果與先前使用這些支架6，8的體內(nèi)異位研究以及兔子的原位植入9，10的有希望的結(jié)果一致。在支架的位置，可以看到骨骼和軟骨階段的再生，盡管可以注意到關(guān)節(jié)表面的明顯壓痕。然而，試點(diǎn)研究的結(jié)果被認(rèn)為足夠令人鼓舞，有理由進(jìn)行更大規(guī)模的長(zhǎng)期研究。

   雖然在主要研究中，臨床癥狀（如跛行或關(guān)節(jié)積液）受到限制，并且并非在所有馬匹中都可見，但在6個(gè)月時(shí)尸檢時(shí)的缺陷填充令人失望，并且在所有治療動(dòng)物中明顯低于試點(diǎn)馬匹。宏觀和組織學(xué)分析證實(shí)存在大壓痕和下修復(fù)組織。從生物力學(xué)上講，這種組織的硬度平均比來自同一匹馬的健康軟骨的樣本低90%。相比之下，來自支架骨部分的3D打印CaP水泥很好地整合到周圍的骨組織中，類似于以前的原位研究13，27。雖然水泥的主要部分已被吸收并被新形成的骨頭取代，但在植入部位內(nèi)仍然可以看到剩余的碎片。X射線衍射（XRD）分析清楚地證實(shí)，作為支架主要成分的刷子和莫氏石被*吸收，只能發(fā)現(xiàn)少量殘留的β-TCP，這可能是由于β-TCP的溶解度（∼0.4 mg / l）低于刷石（85 mg / l）和monetite（41 mg / l）28.所有衍射圖譜均顯示納米晶HA是主要成分，因?yàn)?Theta = 25.8°和31–35°左右的寬峰。這種透明質(zhì)酸可能在支架植入后直接從α-TCP水解為缺鈣的透明質(zhì)酸后形成29，或在較長(zhǎng)的時(shí)間后通過在Ca存在下將刷石轉(zhuǎn)化為HA2+.后者通常出現(xiàn)在原位植入后的刷狀生物水泥中30，因?yàn)樵摶衔镌谏韕H值下熱力學(xué)不穩(wěn)定。由于所用XRD的橫向分辨率為幾毫米2，HA也可能來自支架殘基旁邊新形成的骨礦物質(zhì)。

    在長(zhǎng)期研究中，有幾個(gè)因素可能導(dǎo)致植入物的性能有限。在去細(xì)胞化支架中，已知去細(xì)胞化過程的功效會(huì)影響宿主反應(yīng)，并且在體外更積極的去細(xì)胞化與巨噬細(xì)胞表型優(yōu)勢(shì)從M1到M2的轉(zhuǎn)移有關(guān)。31.雖然沒有得到很好的研究，但獸醫(yī)的臨床印象是，與其他物種相比，馬對(duì)免疫原性刺激相對(duì)敏感，這可能也影響了本研究中植入支架的命運(yùn)。另一個(gè)潛在的非常重要的因素是最初的生物力學(xué)負(fù)荷，包括剪切和壓縮，植入的支架從馬匹從麻醉中恢復(fù)的那一刻起就一直受到。這是馬模型的一個(gè)的缺點(diǎn)。25，這是由于馬匹無法長(zhǎng)時(shí)間卸載其四肢之一而沒有嚴(yán)重的并發(fā)癥。此外，CDM支架有限的整體機(jī)械性能可能通過阻礙力傳遞到下層骨骼而導(dǎo)致失效，最終導(dǎo)致這些區(qū)域的骨質(zhì)流失。這強(qiáng)調(diào)了對(duì)機(jī)械穩(wěn)定性更高的需求，例如，纖維增強(qiáng)結(jié)構(gòu)32，33，用于處理這些機(jī)械上具有挑戰(zhàn)性的位置的缺陷。

通過包含再生細(xì)胞以進(jìn)一步增強(qiáng)組織形成，結(jié)果也可能進(jìn)一步改善。然而，當(dāng)設(shè)想現(xiàn)成的解決方案（即無細(xì)胞結(jié)構(gòu)）時(shí)，這將是一個(gè)復(fù)雜的因素。

    綜上所述，長(zhǎng)期馬研究的不良結(jié)果與體外，異位體內(nèi)和短期體內(nèi)試點(diǎn)研究觀察到的有希望的結(jié)果不一致。在臨床上表現(xiàn)驚人的地方，只有相對(duì)輕微的跛行，在長(zhǎng)期研究中，與為期8周的試點(diǎn)研究的結(jié)果相比，觀察到非常有限的缺陷填充。因此，這項(xiàng)研究強(qiáng)調(diào)了在評(píng)估治療關(guān)節(jié)缺陷的再生方法時(shí)，在具有挑戰(zhàn)性的模型中進(jìn)行長(zhǎng)期研究的必要性，即使體外工作甚至短期體內(nèi)研究的結(jié)果可能是有希望的，因?yàn)橹委熜Ч赡軙?huì)被高估。結(jié)果還表明，在長(zhǎng)期研究期間，例如通過成像技術(shù)或滑液組成的高級(jí)分析，進(jìn)行越來越多的深入監(jiān)測(cè)可能具有實(shí)質(zhì)性的附加值。

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